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柴胡皂苷 柴胡皂苷经不同给药途径血药和脑药动力学的比较研讨

点击:0时间:2021-02-22 00:12:11

戴雅洁 陈晓兰 唐红艳 邓显仪 谢浪

[摘要]经过比较柴胡皂苷经不同途径给药后血药及脑药动力学,点评柴胡皂苷医治癫痫的最佳给药途径。柴胡皂苷经不同途径给予小鼠后于不一起刻点取血和全脑,以乙腈甲醇(9∶1)沉积血浆蛋白质,选用UPLCMS/MS测定SSa在小鼠血浆和脑安排中的浓度,用Kinetica程序软件核算药代动力学参数和生物利费用,并核算脑靶向系数(Re)和药物脑靶向指数(DTI)。鼻腔给药后脑药Re为14217%,DTI为306,要显着高于打针组。灌胃组DTI为125。柴胡皂苷鼻腔给药后脑靶向性要高于打针组和灌胃给药组,显示出鼻腔给药“引药入脑”的优势。

[关键词]柴胡皂苷; 药代动力学; 脑靶向系数; 藥物靶向指数

[Abstract]To evaluate the optimum administration routes of saikosaponin in the treatment of epilepsy by comparing the plasma pharmacokinetics and the brain pharmacokinetics after different administration routes of saikosaponin After receiving saikosaponin in different administration routes, the mice were sacrificed to collect the blood and brain tissues The acetonitrile and methanol (9∶1) were used to precipitate the plasma protein The concentration of the SSa in mice plasma and brain was determined by UPLCMS/MS, and the pharmacokinetic parameters, bioavailability, the brain targeting coefficient (Re) and the brain drug targeting index (DTI) were calculated with Kinetica software The relative brain Re was 14217% by intranasal administration, with DTI of 306, significantly higher than those by the injections; in addition, the brain DTI was 125 by gavage administration The brain drug targeting of saikosaponin by intranasal administration was higher than that by injection and gavage administration, indicating the advantages of the intranasal administration on medicine absorption into the brain

[Key words]saikosaponin; pharmacokinetics; brain targeting coefficient; drug targeting index

柴胡为伞形科植物柴胡Bulperum Chinese DC或狭叶柴胡Bulperum scorzoneri folium Willd的枯燥根,性微寒,味苦、辛,归肝、胆经[1]。现代研讨发现柴胡皂苷具有冷静、抗惊厥的效果,对癫痫有必定的医治效果[2],特别是柴胡皂苷a(SSa),其抗癫痫效果机制或许与按捺N甲基D天冬氨酸受体(NMDAR)激活,按捺NMDAR电流,调理不同的Na+通道或K+通道有关[34]。

本试验经过研讨柴胡皂苷经打针、鼻腔及灌胃给药后,以SSa血药及脑药动力学改动点评柴胡皂苷经3种给药途径吸收入血、入脑的状况,以调查其最佳给药途径,为鼻腔制剂的开发供给必定的理论依据。

1资料

11仪器

UPLC Xevo TQ三重四级杆串联质谱仪(美国Waters);色谱柱Waters BEH C18(21 mm×50 mm,17 μm);MSS型涡旋混合机(美国Scilogex);SK8210HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);HC2062型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);MTN2800型氮吹浓缩设备(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);AUY220型电子天平(日本岛津);AE/240型电子天平(上海梅特勒仪器有限公司);单道可调移液器(上海康敏查验设备有限公式)。

12试药

色谱纯乙腈、甲醇(Merck公司);柴胡皂苷(试验室克己);SSa对照品(批号110777201108,我国食品药品检定研讨院),供含量测定用;甲酸(CNY Technologies);水为屈臣氏蒸馏水;其他试剂均为剖析级。

13动物

昆明种小鼠,雄性,体质量18~25 g,清洁级,由重庆滕鑫生物有限公司供给,合格证号SCXK(渝)20120003。

2办法与成果

21小鼠血浆样品中SSa剖析办法的树立

211色谱条件色谱柱为Waters BEH C18柱(21 mm×50 mm,17 μm);维护柱Waters Van Guard BEH C18(21 mm×5 mm,17 μm);活动相甲醇01%甲酸水(78∶22);流速02 mL·min-1;柱温30 ℃。

212质谱条件电喷雾电离源(ESI);毛细管电离电压3 kV;离子源温度150 ℃;去溶剂气温度550 ℃;喷雾气与反吹气为氮气,去溶剂气流速800 L·h-1,反吹气流速50 L·h-1;扫描办法为多反响监测离子形式(MRM),用于定量剖析监测的离子反响为m/z 80364→33118(SSa);锥孔电压为30 V;磕碰能量为50 eV。

213血浆样品的处理小鼠摘眼球取血05 mL置含有肝素钠的离心管中,1万 r·min-1高速离心10 min,汲取上层血浆100 μL,参加300 μL乙腈甲醇(9∶1)沉积血浆蛋白,涡旋混合器振动60 s,1万 r·min-1高速离心10 min,再取上清液350 μL氮气吹干,再参加甲醇100 μL,复溶,涡旋混合器振动60 s,1万 r·min-1高速离心10min,取上清液2 μL进样。

214色谱行为取小鼠空白血浆、SSa对照品溶液、参加SSa对照品的小鼠血浆和尾静脉打针SSa后的小鼠血浆,按213项处理,进样剖析,比较四者的色谱图,小鼠血浆中杂质不搅扰SSa样品的测定,见图1。

215小鼠血浆样品规范曲线的制备取质量浓度为01,025,05,1,25,5,10,25,50,100,250,500 mg·L-1的SSa对照品溶液各10 μL置离心管中,再参加90 μL空白血浆,涡旋混匀,制形成质量浓度别离为001,0025,005,01,025,05,1,25,5,10,25,50 mg·L-1的SSa含药血浆,按213项办法处理进样剖析。以SSa质量浓度(C)对进SSa峰面积(A)行线性回归,回归方程A=45 050C+7 9013,r=0999 7。成果表明小鼠血浆中SSa在001~50 mg·L-1,峰面积与血中药物浓度呈杰出的线性关系。

216回收率别离取空白血浆90 μL,参加SSa对照品溶液10 μL,制形成含SSa为005,1,10 mg·L-1的血浆样品(n=5),按213项中办法操作。将所得峰面积代入规范曲线核算血浆含药量,与理论值进行比较,核算办法回收率。成果低、中、高浓度的办法回收率别离为1127%,1072%,1063%。办法回收率契合药代动力学试验要求。

别离取空白血浆90 μL,参加SSa对照品溶液10 μL,制形成含SSa为005,1,10 mg·L-1的血浆样品(n=5),按213项中办法操作。另以蒸馏水代替空白血浆进行前述样品的制备,进样剖析。将所得各浓度的血浆样品峰面积与蒸馏水样品峰面积进行比较,核算提取回收率,成果低、中、高浓度的提取回收率别离为1051%,1059%,1011%。提取回收率契合药代动力学试验要求。

217精细度别离取空白血浆90 μL,参加SSa对照品溶液10 μL,制形成含SSa为005,1,10 mg·L-1的血浆样品(n=5),按213项中办法操作。于日内和3 d内各测定3批样品,所得峰面积代入规范曲线核算血浆含药量并进行比较,核算日内和日间精细度。成果低、中、高浓度日内精细度RSD别离为72%,23%,33%;日间精细度RSD别离为10%,25%,31%。精细度契合药代动力学试验要求。

218含药血浆安稳性按215项办法制备质量浓度为005,1,10 mg·L-1的含药血浆各10份,按213项处理,别离调查室温放置24 h的安稳性和冻融3 d的安稳性,进样剖析。所得峰面积代入规范曲线核算浓度,点评含药血浆的安稳性。成果低、中、高浓度的含药血浆常温安稳性RSD别离为49%,38%,35%,冻融安稳性RSD别离为52%,53%,35%。阐明SSa的含药血浆在常温下24 h内安稳,冻融3 d内安稳。

219最低检测限在本试验色谱条件下,最低检测限为250 μg·L-1(S/N≥3),到达SSa体内剖析要求。

22小鼠全脑样品中SSa剖析办法的树立

221色谱条件色谱条件同211项。

222质谱条件质谱条件同212项。

223小鼠全脑样品的提取与别离小鼠脱颈椎处身后,敏捷别离出小鼠全脑,当心吸干全脑上的残留血液,并称重。按15 mL·g-1的份额参加09%氯化钠溶液,匀浆。1万 r·min-1高速离心5 min,汲取上清液200 μL,参加600 μL乙腈甲醇(9∶1)沉积蛋白,涡旋混合器振动60 s,1万 r·min-1高速离心10 min,汲取上清液750 μL氮气吹干,参加100 μL甲醇复溶,涡旋混合器振动60 s,1万 r·min-1高速离心10 min,取上清液2 μL进样。

224色谱行为取空白小鼠脑匀浆、SSa对照品溶液、参加SSa对照品的小鼠脑匀浆和尾静脉打针SSa后的小鼠脑匀浆样品,按223项处理,进样剖析,比较四者的色谱图,小鼠脑中杂质不搅扰SSa样品的测定,见图2。

225小鼠全脑样品规范曲线的制备取空白小鼠全脑,按15 mL·g-1的量参加09%氯化钠溶液匀浆,即得空白脑匀浆液。在15 mL离心管中别离参加质量浓度为0125,025,05,125,25,5,125,25,50 mg·L-1SSa对照品10 μL,吹干后,各参加500 μL空白脑匀浆液,涡旋混合60 s,制形成质量浓度别离为25,5,10,25,50,100,250,500,1 000 ng·g-1的SSa含药脑浆,按223项处理,进样剖析。以SSa浓度(C)对SSa峰面积(A)进行线性回归。回归方程A=34299C-15299,r=0999 8。成果表明小鼠脑中SSa在25~1 000 ng·g-1,峰面积与脑中药物浓度呈杰出的线性关系。

226回收率取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干,参加空白小鼠脑匀浆液500 μL,得到脑中药物浓度为5,50,500 ng·g-1腦匀浆液。按223项处理,进样剖析。代入规范曲线核算测得的脑药含量,与理论值进行比较,核算办法回收率,成果低、中、高浓度办法回收率别离为1042%,1010%,1066%。办法回收率契合脑药代动力学试验要求。

取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干,参加空白小鼠脑匀浆液500 μL,得到脑中药物浓度为5,50,500 ng·g-1脑匀浆液。按223项处理,进样剖析。另以蒸馏水代替空白脑匀浆进行前述样品的制备,进样剖析。将所得各浓度的脑匀浆样品峰面积与蒸馏水样品峰面积进行比较,核算提取回收率,成果低、中、高浓度提取回收率别离为 9723%,

9933%,1056%。提取回收率契合脑药代动力学试验要求。

227精细度取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干,参加空白小鼠脑匀浆液500 μL,得到脑中药物浓度为5,50,500 ng·g-1脑匀浆液。按223项处理,进样剖析。代入规范曲线核算测得量,测定日内和日间的变异,核算精细度,成果低、中、高浓度日内精细度RSD别离为27%,31%,22%,日间精细度RSD别离为26%,32%,17%。精细度契合脑药动力学试验要求。

228含药脑浆安稳性按225项办法制备浓度为5,50,500 ng·g-1的含药脑浆各10份,按223项处理,别离调查室温放置24 h的安稳性和冻融3 d的安稳性,进样剖析。所得峰面积代入规范曲线核算浓度,点评含药脑浆的安稳性。成果低、中、高浓度的含药脑浆安稳性RSD别离为79%,40%,20%。,冻融安稳性RSD别离为52%,53%,35%。阐明SSa的含药脑浆在常温下24 h内安稳,冻融3 d内安稳。

229最低检测限在本试验色谱条件下,最低检测限为250 ng·g-1(S/N≥3),到达SSa体内剖析要求。

23试药制造

231柴胡皂苷滴鼻液制造复合溶媒09%氯化钠溶液乙醇丙二醇(1∶2∶2),在上述复合溶媒中参加柴胡皂苷,超声1 h使之悉数溶解,即得柴胡皂苷滴鼻液,质量浓度为33340 g·L-1。按小鼠20 g計,每只小鼠给药体积为3 μL。

232柴胡皂苷打针液精细汲取上述滴鼻液15 mL,置100 mL量瓶中,以3%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)溶液涣散并稀释至刻度,混匀,以022 μm微孔滤膜滤过,即得质量浓度为50 g·L-1柴胡皂苷打针液。小鼠体质量以20 g计,每只小鼠尾静脉打针02 mL。

233柴胡皂苷灌胃溶液精细汲取232项中滴鼻液75 mL,置100 mL量瓶中,以3%吐温80溶液涣散并稀释至刻度,混匀,即得含量为250 g·L-1柴胡皂苷灌胃液。小鼠体质量以20 g计,每只小鼠灌胃1 mL。

234小鼠分组及给药取雄性KM小鼠120只,体质量20~25 g,随机分为3组,每组40只,别离为柴胡皂苷鼻腔组、柴胡皂苷打针组和柴胡皂苷灌胃组。动物于试验前12 h禁食,自在饮水。将3组小鼠按等剂量经鼻腔、打针和灌胃给药。

鼻腔给药时,以乙醚麻醉小鼠,固定头部,用衔接PE塑料软管的微量打针器刺进小鼠鼻腔内约02 cm,将定量药物给入鼻腔,调查是否有药液从小鼠鼻腔丢失。各组给药后,别离在1,3,5,10,30,60,90,120 min选材,每组每个时刻点5只小鼠,摘眼球取血05 mL,别离血浆备用。取血后当即脱颈椎处死小鼠,敏捷别离出小鼠全脑,当心吸干全脑上的残留血液,称重。按15 mL·g-1的份额参加09%氯化钠溶液,匀浆,备用。

24小鼠经不同途径给药后SSa血药动力学数据

各组给药后,按血浆样品处理办法处理样品,UPLCMS/MS测定并核算其间SSa的浓度,均匀血药时曲线见图3。

25小鼠经不同途径给药后SSa血药动力学参数

将3组血药浓度时刻数据用Kinetica药动学软件拟合,拟合办法挑选非房室(non compartment method)。

将鼻腔给药和灌胃给药后的SSa血药时刻曲线下面积(AUC)与静脉打针给药组的AUC相比较,选用公式

F=AUC0→t(鼻腔/灌胃)/X(鼻腔/灌胃)AUC0→t(打针)/X(打针)×100%。得到鼻腔和灌胃给药后的肯定生物利费用F,其间X为给药剂量,见表1。

由表1可知,灌胃组与鼻腔组比较,AUC0→120无显着差异,但F差异有统计学含义(P<001)。鼻腔组F显着大于灌胃组,阐明柴胡皂苷鼻腔给药的生物利费用显着高于灌胃。

26小鼠经不同途径给药后SSa脑药动力学数据

各组给药后,按脑匀浆样品处理办法处理样品,UPLCMS/MS测定并核算其间SSa的浓度,均匀脑药时曲线见图4。

27小鼠经不同途径给药后SSa脑药动力学参数

将3组脑药浓度时刻数据用Kinetica药动学软件拟合,拟合办法挑选非房室。

将鼻腔给药和灌胃给药后SSa脑药时刻曲线下AUC与静脉打针给药组的AUC相比较,选用公式Re=AUC(鼻腔/灌胃)AUC(打针) ×100%,得到鼻腔液和灌胃液的相对脑靶向系数Re。以鼻腔、灌胃及打针途径给药后血药浓度下面积AUC为参比,选用公式Te=AUC0→t(脑)AUC0→t(血) ,得到打针给药、鼻腔给药及灌胃给药的脑药/血药份额系数Te;以各组Te核算药物靶向指数DTI,DTI=Te鼻腔/Te打针,见表2。

由表2可知,鼻腔给药后脑内达峰时刻tmax为5 min,比较打针给药3 min稍慢。鼻腔组的Re为14217%,DTI为306,打针组和灌胃组比较,差异有统计学含义。鼻腔组Re和DTI要显着高于打针组和灌胃组,阐明鼻腔给药脑靶向性好,生物利费用高,而灌胃给药吸收少,生物利费用低。

3评论

因为柴胡皂苷有溶血的副效果[5],打针药液浓度较高会引起大鼠痉挛或逝世,影响试验成果。本试验以50 mg·kg-1尾静脉打针后不会对小鼠形成损伤。而柴胡皂苷灌胃吸收生物利费用低,在预试验和参阅其他柴胡皂苷药动学的给药剂量后[6],本试验将灌胃给药的剂量提高了25倍。

本课题经过研讨柴胡皂苷不同给药途径小鼠给药后SSa血药及脑药动力学的差异,从体内进程的视点论述不同给药途径在医治脑病急症的优势和缺乏。从血药及脑药动力学进程能够看出,打针血药峰浓度是3种给药途径中最高的,Cmax为(4685±095) mg·L-1,而打针脑药浓度Cmax亦到达(53914±11412) ng·g-1。但在临床上打针给药也有必定的不良反响[78]。

尽管口服给药最易被患者所承受且医治成本低,安全性高。但依据表1中25倍量灌胃剂量的血药浓度Cmax为(314±009) mg·L-1 ,脑药浓度Cmax为(8996±965)ng·g-1,F为207%。而依据表2中的Cmax灌胃/Cmax打针核算出脑药峰浓度仅为打针给药后的1/6,相对靶向系数Re为6460%,DTI为125。口服给药或许需求运用适当于打针给药的150倍以上的給药剂量,才干到达与打针给药适当的血内药量和脑内药量。较大的口服给药剂量和给药频率关于癫痫患者的医治是不方便的,一起也或许加剧患者的肝肾担负。另一方面药物经灌胃入血和入脑都需求较长的时刻,不利于癫痫患者的突发急救。

鼻腔给药后的血药浓度Cmax为(552±019) mg·L-1,脑药浓度Cmax为(44084±5579) ng·g-1可到达打针的4/5,F达4645%,Re为1422%,DTI为306,且入血和入脑速度极快,可发挥速效救急效果,运用方便,安全性也较打针剂大大提高,因此是一种值得深化开发的脑病医治给药途径。

当然本课题是以正常小鼠为模型得到的成果,而当急性癫痫发生后,在以上3种给药途径下,血药、脑药动力学或许会有相应改动,具体状况有待进一步研讨。

[参阅文献]

[1]我国药典 一部[S] 2015.

[2]陈伟军SSa的抗惊厥及冷静催眠效果的试验研讨[D]广州:南边医科大学,2013:14

[3]孟春想SSa对难治性癫痫大鼠痫性发生及PGP表达的影响[D]广州:南边医科大学,2013:7

[4]于云红SSa对大鼠海马神经元癫痫样放电按捺效果及相关离子通道电流调理效果的研讨[D]广州:南边医科大学,2013:18

[5]张国松,封传华,罗晓健,等柴胡总皂苷提取物体外溶血效果[J]我国试验方剂学杂志,2011,17(20):166

[6]刘史佳柴胡皂苷a的药代动力学及药物相互效果研讨[D]南京:南京中医药大学,2010:44

[7]张翠平柴胡打针液的不良反响研讨[J] 临床医药文献电子杂志,2016,35(6):1173

[8]于红权柴胡打针液的药理及不良反响剖析[J] 临床医药文献电子杂志,2016,35(1):167

[责任编辑张燕]

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